FACS süreci, hücrelerin, hücrelerdeki spesifik proteinlere veya nükleik asitlere bağlanan floresan antikorlar veya boyalarla etiketlenmesiyle başlar. Bu floresan işaretleyiciler, akış sitometresinin, hedef moleküllerin ekspresyonuna dayalı olarak farklı hücre tiplerini tespit etmesine ve bunlar arasında ayrım yapmasına olanak tanır. Deneysel gereksinimlere bağlı olarak hücreleri etiketlemek için floresan proteinler ve ara boyalar da kullanılabilir. Bu etiketleme, hücreler akış sitometresinden geçerken cihazın floresan yoğunluğunu hassas bir şekilde ölçebilmesini sağlar.

Etiketlendikten sonra hücre karışımı, cihazın akış hücresinden tek bir dosya halinde akar. Her bir hücre bir lazer ışınından geçerken, dedektör üç temel parametreyi yakalar: floresans, ileri-dağılımlı ışık (FSC) ve yan-dağılımlı ışık (SSC). FSC, hücrenin boyutu hakkında bilgi sağlarken SSC, hücrenin iç karmaşıklığı veya ayrıntı düzeyi hakkında bilgi verir. Floresan sinyaller, hücre yüzeyinde bulunan proteinler veya işaretleyiciler hakkında spesifik veriler sağlayarak hücre popülasyonları arasında daha fazla farklılaşmaya olanak tanır.

FACS cihazları, farklı dalga boylarındaki floresansı ölçmek için birden fazla lazer, filtre ve detektörle donatılmıştır ve birden fazla floresan işaretleyicinin aynı anda tespit edilmesini sağlar. Bu çok parametreli tespit, karmaşık hücre karışımlarının tanımlanmasını ve sınıflandırılmasını gerektiren deneyler için anahtardır. FACS'nin çok yönlülüğü, kullanıcıların deneylerini belirli floresan işaretleyicilere ve analiz edilen hücrelerin özelliklerine göre uyarlamalarına olanak tanır.

Hücrenin özellikleri analiz edildikten sonra cihaz, hücreleri fiziksel olarak farklı kaplara ayırmak için elektrostatik sapmayı kullanıyor. Kullanıcı tarafından tanımlanan belirli kriterleri karşılayan hücreler ücretlendirilir ve belirlenen kaplara yönlendirilir. Bu hassas sıralama işlemi, araştırmacıların daha fazla analiz veya deneysel manipülasyon için hücre alt popülasyonlarını izole etmesine olanak tanır ve FACS'yi oldukça spesifik hücre popülasyonları gerektiren deneyler için önemli bir araç haline getirir.