O processo FACS começa marcando as células com anticorpos fluorescentes ou corantes que se ligam a proteínas ou ácidos nucleicos específicos nas células. Esses marcadores fluorescentes permitem que o citômetro de fluxo detecte e distinga entre diferentes tipos de células com base na expressão de moléculas alvo. Proteínas fluorescentes e corantes intercalantes também podem ser usados ​​para marcar células, dependendo dos requisitos experimentais. Esta marcação garante que o instrumento possa medir com precisão a intensidade da fluorescência à medida que as células passam pelo citômetro de fluxo.

Uma vez rotulada, a mistura de células flui através da célula de fluxo do instrumento em um único arquivo. À medida que cada célula individual passa por um feixe de laser, o detector captura três parâmetros principais: fluorescência, luz difusa direta (FSC) e luz difusa lateral (SSC). O FSC fornece informações sobre o tamanho da célula, enquanto o SSC fornece insights sobre a complexidade ou granularidade interna da célula. Os sinais fluorescentes fornecem dados específicos sobre as proteínas ou marcadores presentes na superfície celular, permitindo maior diferenciação entre as populações celulares.

Os instrumentos FACS são equipados com vários lasers, filtros e detectores para medir a fluorescência em diferentes comprimentos de onda, permitindo a detecção simultânea de vários marcadores fluorescentes. Essa detecção multiparâmetro é fundamental para experimentos que exigem a identificação e classificação de misturas celulares complexas. A versatilidade do FACS permite aos usuários adaptar seus experimentos com base em marcadores fluorescentes específicos e nas características das células que estão sendo analisadas.

Uma vez analisadas as propriedades da célula, o instrumento utiliza a deflexão eletrostática para classificar fisicamente as células em diferentes recipientes. As células que atendem a critérios específicos definidos pelo usuário são carregadas e desviadas para contêineres designados. Este processo de classificação preciso permite aos pesquisadores isolar subpopulações de células para análise posterior ou manipulação experimental, tornando o FACS uma ferramenta essencial para experimentos que requerem populações de células altamente específicas.