Il processo FACS inizia etichettando le cellule con anticorpi fluorescenti o coloranti che si legano a proteine ​​o acidi nucleici specifici nelle cellule. Questi marcatori fluorescenti consentono al citometro a flusso di rilevare e distinguere tra diversi tipi di cellule in base alla loro espressione di molecole bersaglio. Per etichettare le cellule possono essere utilizzati anche proteine ​​fluorescenti e coloranti intercalanti, a seconda delle esigenze sperimentali. Questa etichettatura garantisce che lo strumento possa misurare con precisione l'intensità della fluorescenza mentre le cellule passano attraverso il citometro a flusso.

Una volta etichettata, la miscela cellulare scorre attraverso la cella a flusso dello strumento in un unico file. Mentre ogni singola cellula passa attraverso un raggio laser, il rilevatore cattura tre parametri chiave: fluorescenza, luce diffusa in avanti (FSC) e luce diffusa lateralmente (SSC). L'FSC fornisce informazioni sulla dimensione della cella, mentre l'SSC fornisce informazioni sulla complessità interna o sulla granularità della cella. I segnali fluorescenti forniscono dati specifici sulle proteine ​​o marcatori presenti sulla superficie cellulare, consentendo un'ulteriore differenziazione tra le popolazioni cellulari.

Gli strumenti FACS sono dotati di più laser, filtri e rilevatori per misurare la fluorescenza su diverse lunghezze d'onda, consentendo il rilevamento simultaneo di più marcatori fluorescenti. Questo rilevamento multiparametrico è fondamentale per gli esperimenti che richiedono l'identificazione e lo smistamento di miscele cellulari complesse. La versatilità del FACS consente agli utenti di personalizzare i propri esperimenti in base a specifici marcatori fluorescenti e alle caratteristiche delle cellule analizzate.

Una volta analizzate le proprietà della cella, lo strumento utilizza la deflessione elettrostatica per ordinare fisicamente le celle in contenitori diversi. Le celle che soddisfano specifici criteri definiti dall'utente vengono caricate e trasferite in contenitori designati. Questo preciso processo di smistamento consente ai ricercatori di isolare sottopopolazioni di cellule per ulteriori analisi o manipolazioni sperimentali, rendendo FACS uno strumento essenziale per esperimenti che richiedono popolazioni cellulari altamente specifiche.