Proses FACS dimulai dengan memberi label sel dengan antibodi atau pewarna fluoresen yang mengikat protein atau asam nukleat tertentu di dalam sel. Penanda fluoresen ini memungkinkan flow cytometer mendeteksi dan membedakan berbagai jenis sel berdasarkan ekspresi molekul targetnya. Protein fluoresen dan pewarna interkalasi juga dapat digunakan untuk memberi label pada sel, bergantung pada persyaratan eksperimen. Pelabelan ini memastikan bahwa instrumen dapat mengukur intensitas fluoresensi secara tepat saat sel melewati flow cytometer.

Setelah diberi label, campuran sel mengalir melalui sel aliran instrumen dalam satu file. Saat setiap sel melewati sinar laser, detektor menangkap tiga parameter utama: fluoresensi, cahaya sebaran depan (FSC), dan cahaya sebar samping (SSC). FSC memberikan informasi tentang ukuran sel, sedangkan SSC memberikan wawasan tentang kompleksitas atau granularitas internal sel. Sinyal fluoresen memberikan data spesifik tentang protein atau penanda yang ada pada permukaan sel, memungkinkan diferensiasi lebih lanjut antar populasi sel.

Instrumen FACS dilengkapi dengan beberapa laser, filter, dan detektor untuk mengukur fluoresensi pada panjang gelombang berbeda, sehingga memungkinkan deteksi beberapa penanda fluoresen secara bersamaan. Deteksi multi-parameter ini adalah kunci untuk eksperimen yang memerlukan identifikasi dan penyortiran campuran sel yang kompleks. Fleksibilitas FACS memungkinkan pengguna untuk menyesuaikan eksperimen mereka berdasarkan penanda fluoresen tertentu dan karakteristik sel yang dianalisis.

Setelah sifat-sifat sel dianalisis, instrumen menggunakan defleksi elektrostatik untuk secara fisik menyortir sel ke dalam wadah yang berbeda. Sel yang memenuhi kriteria spesifik yang ditentukan pengguna akan dikenakan biaya dan dialihkan ke wadah yang ditentukan. Proses penyortiran yang tepat ini memungkinkan peneliti mengisolasi subpopulasi sel untuk analisis lebih lanjut atau manipulasi eksperimental, menjadikan FACS alat penting untuk eksperimen yang memerlukan populasi sel yang sangat spesifik.